A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) é uma técnica muito comum usada para análise de misturas complexas de polipeptídeos. Tem grande poder de resolução, é rápido e é adequado para proteínas de pI ácido ou básico. A última é porque a proteína reage com o SDS, que se liga à proteína na proporção aproximada de 1∶4∶1 (SDS: proteína, p / p) e transmite uma carga negativa ao complexo SDS-proteína. Os complexos carregados movem-se em direção ao ânodo quando colocados em um campo elétrico e são separados com base nas diferenças de carga e tamanho. O SDS-PAGE é comumente usado para estimar os pesos moleculares das proteínas, mas as estimativas são aproximadas (sendo denominadas “pesos moleculares aparentes”) e às vezes sujeitas a erros marcantes.
Por exemplo, aumentos desproporcionalmente grandes no peso molecular aparente podem ocorrer após fosforilação covalente de uma proteína ( 1 ), ou aprisionamento artificial de ácido fosfórico ( 2 ). A maioria dos projetos de SDS-PAGE emprega um “gel de empilhamento”. Tal sistema permite a concentração de amostras de volumes comparativamente grandes a zonas muito pequenas dentro do gel, dando assim bandas estreitas das diferentes proteínas, que são então melhor resolvidas.
O princípio envolvido nesta concentração de proteína (ou “empilhamento”) é o da isotacoforese. É montado fazendo-se um gel de empilhamento sobre o “gel separador”, que tem um pH diferente. A amostra é aplicada no gel de empilhamento e quando o campo elétrico é aplicado, os complexos carregados negativamente e os íons menores se movem em direção ao ânodo.
Protein sequencing
O que é eletroforese de proteínas?
A eletroforese de proteínas é uma técnica laboratorial padrão pela qual moléculas de proteínas carregadas são transportadas através de um solvente por um campo elétrico. As proteínas e os ácidos nucléicos podem ser separados por eletroforese, que é uma ferramenta analítica simples, rápida e sensível. A maioria das moléculas biológicas carrega uma carga líquida em qualquer pH diferente de seu ponto isoelétrico e irá migrar a uma taxa proporcional à sua densidade de carga. A mobilidade de uma molécula através de um campo elétrico dependerá dos seguintes fatores: força do campo, carga líquida na molécula, tamanho e forma da molécula, força iônica e propriedades da matriz através da qual a molécula migra (por exemplo, viscosidade, tamanho dos poros). A poliacrilamida e a agarose são duas matrizes de suporte comumente usadas em eletroforese. Essas matrizes servem como meios porosos e se comportam como uma peneira molecular. A agarose tem um tamanho de poro grande e é adequada para separar ácidos nucléicos e grandes complexos de proteínas. A poliacrilamida tem um tamanho de poro menor e é ideal para separar a maioria das proteínas e ácidos nucléicos menores.
Existem várias formas de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), e cada forma pode fornecer diferentes tipos de informações sobre proteínas de interesse. A desnaturação e redução de dodecilsulfato de sódio PAGE (SDS-PAGE) com um sistema tampão descontínuo é a técnica de eletroforese mais amplamente usada e separa as proteínas principalmente por massa. A PAGE não desnaturante, também chamada de PAGE nativa, separa as proteínas de acordo com sua relação massa / carga. O PAGE bidimensional (2D) separa as proteínas por ponto isoelétrico nativo na primeira dimensão e por massa na segunda dimensão.
