DESCRIÇÃO
Os métodos de separação baseados em contas e colunas dependem muito da velocidade e facilidade dos sistemas de ligação por afinidade. Ligantes como estreptavidina, anticorpos e
lectinas são usados ​​para capturar alvos marcados especificamente e para o isolamento de células e biomoléculas que expressam naturalmente o parceiro de ligação ao ligante.
As propriedades únicas de ligação de sacarídeos das lectinas vegetais, como a Concanavalina A (Con A), as tornaram úteis para a marcação e isolamento de células que apresentam glicano e glicoproteínas no soro e lisado celular. Além disso, as lectinas têm sido usadas em estudos de adesão celular, para efetuar a ativação de linfócitos e
para explorar a terapêutica baseada em carboidratos.
Nossas micropartículas BioMag Plus revestidas com Con A fornecem um meio conveniente para isolar glicoproteínas e
polissacarídeos contendo manosil e glucosil do soro ou lisado celular, ou para investigar outros processos mediados por lectina / glicano. O BioMag Concanavalin A também foi usado para
CUT & RUN, um protocolo de criação de perfil de cromatina que tem várias vantagens importantes sobre o ChIP. (ver referências)
CARACTERÍSTICAS
Concanavalina A (Con A) é covalentemente ligada a
partículas BioMag®Plus funcionalizadas para uso em isolamentos de glicoproteína de extratos celulares e séricos.
Con A é uma proteína de 104.000 Da composta por quatro subunidades idênticas e existe
como um dímero ou tetrâmero ativo dependendo do pH. Sua ligação a carboidratos
os parceiros são α-D-glicose e α-D-manose com grupos OH não modificados em
C-3, C-4 e C-6, e resíduos terminais de glicose de proteínas e peptídeos.
Con A aglutina os glóbulos vermelhos (RBCs), interage com
glicopeptídeos de imunoglobulina e é um mitógeno de linfócitos. Ele se liga a algumas bactérias.
A ligação de Con A é mediada por íons metálicos, que estabilizam em conformação. Cada
sítio de ligação requer íons de cálcio e manganês, e o uso de tampões com EDTA
ou outros quelantes de metal resultará na perda da capacidade de ligação de carboidratos.
Diâmetro médio: ~ 1,0 µm
Concentração: 5 mg / mL Limite de
Con A: determinado por A280

MATERIAL
Material fornecido
3mL ou 10mL de partículas revestidas com Con A em PBS 10mM com azida de sódio 0,1%
Material necessário
Tubos de microcentrífuga de 1,5mL ou 2mL
Soro de mamífero: 0,4mL de uma diluição 1:20 em PBS /
Tampão de ligação de teste : 1x PBS + NaN3 0,1%
+ 1mM MgCl2
+ 1mM MnCl2
+ 1mM CaCl2
(pH 7,4)
Tampão de lavagem: 1x PBS + 0,1% NaN3
+ 1mM MgCl2
+ 1mM MnCl2
+ 1mM CaCl2
(pH 7,4) + 0,1% Tween® 20
Con A partícula Tampão de Eluição: 5mM Tris (pH 8,0 ) + NaCl 0,15 M + SDS a 0,05% + pipetas de precisão de glicose 1M
com pontas descartáveis ​​para fornecer 20-200 µL, 200-1000 µL
Separador de tubo de microcentrífuga: Separador magnético de 1,5 mL (código de catálogo LS001) Separador de tubo de microcentrífuga BioMag Multi-6 (código de catálogo MS002)
Misturador de vórtice e rotador de tubo.

PROCEDIMENTO Os
pesquisadores são aconselhados a otimizar o uso de partículas em qualquer aplicação.
1. Prepare 0,4mL de amostra de soro diluindo 1:20 com PBS 10mM.
2. Transfira 1mL de partículas BioMag®Plus Con A para um tubo de microcentrífuga limpo. Coloque o tubo em um ímã para separar as partículas da solução.
Remova e descarte a solução com cuidado.
3. Lave as partículas adicionando 1mL de tampão de ligação. Misture bem.
4. Repita a lavagem de partículas mais uma vez. Após a última lavagem, remova o sobrenadante.

5. Adicione 0,1mL de tampão de ligação à amostra de soro do Passo 1. Adicione a amostra às partículas e misture bem por inversão ou vórtice para ressuspender as partículas.
6. Coloque a amostra em um rotador de tubo e misture por 10-30 minutos em temperatura ambiente.
7. Remova a amostra do rotador e coloque em um separador magnético. Remova cuidadosamente o sobrenadante limpo.
8. Lave as partículas adicionando 0,5mL de tampão de lavagem. Misture bem por inversão ou por mistura de vórtice.
9. Repita as etapas 7 a 8. Ressuspenda as partículas com 0,5mL de tampão de lavagem e coloque no rotor do tubo por 5 minutos.
10. Repita as etapas 7 a 9.
11. Substitua o tubo de partículas no separador magnético e remova / descarte cuidadosamente o sobrenadante.
12. Adicione 250 µL de tampão de eluição às partículas. Misture o tubo para ressuspender as partículas e coloque o tubo no rotador por 10-30 minutos em temperatura ambiente.
13. Substitua o tubo de partículas no separador magnético e remova cuidadosamente o eluato e transfira para um tubo de microcentrífuga limpo para uso posterior ou armazenamento.
14. Repita as etapas 12-13. Os eluatos podem ser agrupados e precipitados. Armazene os eluatos em gelo para uso imediato ou congele para armazenamento de longo prazo.
NOTAS
• Evite o uso de reagentes com EDTA ou outros quelantes de metal, pois isso reduzirá a eficácia do tampão de ligação.
• Inibidores de protease podem ser usados ​​quando glicoproteínas sensíveis são isoladas.
• A recuperação de baixa glicoproteína pode ser anexada aumentando o tempo de incubação de eluição além de 10 minutos e / ou fervendo as partículas em 200 µL de
tampão de amostra SDS-PAGE por 5 minutos e, em seguida, separando magneticamente as partículas do eluato. (Observação: a fervura pode separar algumas lectinas e
também pode liberar proteínas não especificamente ligadas.)
• Execute as amostras de eluato em um gel de eletroforese SDS-PAGE 4-20% Tris-Glycine e corar as bandas de glicoproteína usando o kit de coloração GlycoGel
(código de catálogo da Polysciences 24693) para visualizar.
• Após a coloração com GlycoGel, corar o gel usando Coomassie G250 (1mL ou 2mL de 0,5% de Coomassie G250 em 50% de metanol e 10% de ácido acético) para visualizar
outras bandas de proteína.
• A remoção de albumina e IgG das amostras de soro pode melhorar o isolamento de glicoproteínas de baixa concentração. Se desejar, use o
Kit de remoção de albumina BioMag® ProMax (código de catálogo BP658) e / ou o kit de remoção de IgG de soro BioMag® ProMax (código de catálogo BP659).